稳定同位素探测 (SIP) 是一种通过实验识别微生物组内特定代谢的有效方法，使研究人员能够询问这些复杂的微生物群落。微生物群落可以通过多种方式用稳定同位素进行探测，例如评估用液相色谱法分离的磷脂脂肪酸的同位素含量，或通过对已与未标记的同位素标记的 DNA 或 RNA 进行测序DNA 或 RNA 通过密度离心。这些是对微生物群落进行批量分析的有价值的方法，并且都有其优点和缺点。然而，所有这些技术的一个共同缺点是它们不能捕获空间信息和活动中的小区间变化。
单细胞稳定同位素探测 (SC-SIP) 包含多种技术，这些技术通常利用拉曼显微光谱或纳米级二次离子质谱 (NanoSIMS) 来实现对细胞、细胞成分和代谢物中同位素示踪剂的空间分辨跟踪。近日，来自奥地利维也纳大学的研究团队在Nature子刊《ISME Communications》上发文，系统介绍了单细胞稳定同位素探测（SC-SIP）如何应用于推进微生物学中的重要研究问题，并提供对未来方向和机遇的展望。
SIP最常单独或组合使用氢、氮和碳的稳定同位素。氢的重同位素 - 氘 - 可以以重水 (D2O) 或有机 D 的形式使用。可以使用 15N 标记的含氮化合物（例如氮气、铵或有机氮（例如氨基酸））来跟踪氮的命运。为了探测碳代谢，13C 可以作为示踪剂以 CO2 的形式（或在水相中以碳酸氢盐的形式）或有机-C的形式使用。
一、SC-SIP 如何以空间和时间分辨的方式监测微生物细胞活动和识别复杂环境中的代谢过程。
1.SC-SIP 已成功用于检测宿主-病原体系统中的细胞微生物活性。
案例：为了评估金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌在囊性纤维化生物膜中的细胞活性，研究人员使用恒化器反应器以产生不同的细菌生长速率，量化了重水中的氘和 15N 铵中的 15N 掺入微生物生物质中。证明了生长速率可以从细胞氘掺入中推断出来，并且能够使用双重标记策略来估计铵和氨基酸同化对细菌生长的相对贡献。然后通过对 CF 患者新鲜咳出的痰液施加重水，他们发现金黄色葡萄球菌的生长速度比实验室培养细胞时通常获得的生长速度至少低两个数量级，并且有相当多的细胞-金黄色葡萄球菌种群中生长速率的细胞间异质性。
2.在各种环境中，使用 SC-SIP 在细菌和原生动物中探索了微生物休眠。
案例：研究人员使用重水 SIP 结合成像质谱法研究了在其宿主中形成肉芽肿性病变的寄生虫 Leishmania mexicana 的原位代谢状态。感染小鼠肉芽肿的成像显示肉芽肿内混合了活跃和非活跃的利什曼原虫细胞群，令人惊讶的是，周围间皮中还有大量代谢静止的细胞，作者推测这可能是一个重要的病原体在药物治疗中存活的机制。
3.使用 SC-SIP 研究微生物代谢策略。
（1）量化混合营养
案例：同时使用不同的能源和碳源。在吞噬藻Ochromonas sp中量化混合营养。通过在热灭活的 13C/15N 标记的细菌或未标记的热灭活细菌以及 13C-碳酸氢盐和 15N-铵 的存在下生长藻类，对吞噬性藻赭单胞菌菌株BG-1的混合营养进行了量化。NanoSIMS 分析以及体积同位素比质谱法 (IRMS) 表明，Ochromonas 从消耗的细菌中获得了大部分 C (84-99%) 和 N (88-95%)，并且可以检测到自养活性但不足以支持细菌增长。
（2）检测复杂微生物群落中的化学自养和异养
案例：研究人员使用与 13C-碳酸氢盐和 15N-氨基酸一起孵育的海水样品，然后进行 NanoSIMS 测量，发现样品中只有少数的活性细胞是化学自养的。当向样品中添加抗生素以特异性抑制细菌时，具有化学自养代谢的活性细胞比例增加。这表明，其活性不受抗生素抑制的古细菌可能是大部分化学自养的原因。
(3)SC-SIP 可以提供一种工具，用于发现具有特定功能的新型微生物。
案例：为了识别海洋样品中的自养生物，研究人员用13C-碳酸氢盐培养样品，然后使用拉曼活化细胞喷射 (RACE) 对 13C 标记的细胞进行分类。通过对分选的细胞进行鸟枪法测序，他们能够从新的、未培养的聚球藻属中重建几乎完整的基因组。
4） SC-SIP 已被用于区分不同的有机碳利用途径
案例：研究人员通过种植假单胞菌属的纯培养物。在重水和13C-葡萄糖或 13C-萘存在下的大肠杆菌，用拉曼显微光谱观察到两种生物之间合成苯丙氨酸氘化的差异，他们提出这是由于其苯丙氨酸生物合成途径的差异。
二、如何使用 SC-SIP 方法来确定不同微生物环境中表型异质性的普遍性和相关性？
案例1：在一项环境研究中，研究人员通过检查来自瑞士卡达诺湖的单细胞对 N2 和 CO2 的固定情况，描述了绿色硫细菌 Chlorobium phaeobacteroides 的表型异质性。研究人员在存在或不存在 NH4 的情况下将湖水与 15N2 和 13CO2 一起孵育，并使用基于 C. phaeobacteroides 的自发荧光的细胞分选将环境中的细胞浓缩两个数量级。然后，他们使用 NanoSIMS 测量了稳定同位素的掺入，发现 C. phaeobacteroides仅在没有 NH4 的情况下固定 N2。此外，他们能够证明 N2 和 CO2 的固定是异质的，并且在细胞间呈正相关，这表明 N2 的固定和 CO2 的固定在单个细胞内相互作用并相互促进。
案例2：在异养微生物种群内表型异质性的另一项研究中，使用 SC-SIP 在大肠杆菌的克隆细菌种群中发现了糖代谢的变化。通过在 2H/13C 标记糖存在的情况下在恒化器中培养大肠杆菌，研究人员发现单细胞之间的代谢活动存在很大差异，无论是整体同化率还是糖特异性同化，如 NanoSIMS 所测量的。作者提出，这种异质性至少可以部分解释为细胞间基因表达的变异，或转录水平的表型异质性。
三、SC-SIP如何用于揭示微生物之间的代谢相互作用，以及如何识别和量化共生生物之间“交换的货币”。
1.SC-SIP 用于研究在各种情况下，包括在正常光合作用驱动的碳同化、热应激和混合自养和异养喂养策略。
案例：海绵和细菌之间的共生是一种普遍存在且具有重要生态学意义的相互作用，已知它在海洋中溶解有机物 (DOM) 的循环中发挥着重要作用 。海绵及其共生体有多种营养策略；然而，大多数海绵是异养滤食者，它们通过称为软骨细胞的特殊细胞捕获食物。细菌共生体对海绵异养的贡献最近才被量化。在对这种共生关系的调查中，SC-SIP 用于比较具有高或低丰度微生物共生体的海绵对不同来源 DOM 的消耗。在使用不同类型的 13C-DOM 和 15N-DOM 进行的原位喂养实验中，作者证明 DOM 是两种海绵类型的主要碳源，约占其异养日粮的 90%。微生物占 DOM 的大部分 (65-87%) 被具有高丰度微生物的海绵同化，约占其异养饮食总量的 60%，但在含有低丰度微生物的海绵中不到 5%。与通常假设的不同，这些发现定量地表明，不仅宿主的软骨细胞，而且微生物共生体都积极参与 DOM 处理，并且与其丰度成正比。
2.SC-SIP 是研究共生伙伴之间代谢物交换的强大工具
案例：在最近的一项研究中，海洋 haptophyte Braarudosphaera bigelowii 和世界性海洋蓝藻 UCYN-A 之间的共生受到了外部供应构成共生基础的溶解无机氮 (DIN) 的挑战 。为共生伙伴提供稳定同位素 15N2、15NO3-、15NH4+ 和 H13CO3 的外部来源，作者可以使用 SC-SIP 和 CARD-FISH 确定固氮率、溶解无机氮吸收率和固碳率.作者发现，尽管与 UCYN-A 的共生关系是基于 N2 固定并与单植物共享，但在含有 DIN 的富氮水域中，单植物仍然依赖 UCYN-A 固氮来获得大部分氮。他们提出，尽管有 DIN 的外部来源，但这种生物地球化学上重要的共生关系甚至可以在富含氮的沿海水域中维持。
3.SC-SIP 方法也被用来说明电子转移形式的能量货币如何调解共生关系，特别是在能量有限的环境中。
4.使用 SC-SIP 进行的研究还通过提供同位素标记的代谢物并跟踪它们的通道，对识别微生物食物网中类群的营养相互作用做出了重要贡献。
案例：使用重水 SIP 孵育，然后进行拉曼活化细胞分选和宏基因组测序，Pereira 及其同事发现小鼠肠道微生物群中 Homothermaceae 成员内的黏膜聚糖协同降解的迹象。具体来说，作者发现该组的不同成员编码不同的酶，这些酶有助于粘膜聚糖的逐步降解，这表明降解是一个相互的、群落水平的过程。
SC-SIP 已用于微生物生态学的各种系统中，研究人员预计该技术在不久的将来会有更多的应用和发展。例如，使用 NanoSIMS 对化合物进行亚细胞定位已被用于医学研究以识别含铂抗癌药物的细胞靶标，以及用于环境微生物学以研究趋磁细菌中的磁小体以及真菌纳米相颗粒介导真菌-矿物相互作用。使用 NanoSIMS 对化合物进行亚细胞定位可能在微生物生态学中具有许多其他应用，例如在微生物细胞中定位金属同位素以定位具有金属辅助因子（如铁、铜、锌或镍）的酶，或量化蛋白质周转率细胞中的速率。
SC-SIP 在微生物生态学未来应用中的全部潜力可以通过将该技术与允许更精确、更可靠的单细胞询问的技术发展相结合来释放。显示出前景的新兴技术包括受激拉曼散射显微镜，这是一种振动光谱技术，可快速灵敏地检测细胞生物质中的同位素，有助于在前所未有的大面积上进行测量。现有方法的组合，或多模式成像方法，如成像 MS 、振动光谱和荧光标记/报告基因（例如，转录融合报告基因或 BONCAT），有可能更全面地将微生物身份、活性联系起来，以及以空间分辨和非侵入性的方式产生代谢物。期望这些和其他发展将进一步扩大 SC-SIP 的范围和力量，并推动整个微生物生态学令人兴奋的新发现。
热耳科技是剑桥同位素总代理（Cambridge Isotope Laboratories）。提供上述实验用到的2H，13C，15N，18O同位素标记物。
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